腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)基反復(fù)貼壁法和機(jī)械刮除法步驟
根據(jù)腫瘤細(xì)胞比成纖維細(xì)胞貼壁速度慢的特點(diǎn)，并結(jié)合使用不加血清的營養(yǎng)液，把含有兩類細(xì)胞的細(xì)胞懸液反復(fù)貼壁，使兩類細(xì)胞相互分離，操作方法與傳代相同。
（1）待細(xì)胞生長達(dá)一定數(shù)量后，倒出舊培養(yǎng)液，用胰酶消化后，Hanks 沖洗2次，加入不含血清的培養(yǎng)液，吹打制成細(xì)胞懸液；
（2）取編號為此A、B、C三個培養(yǎng)瓶；首先把懸液接種入A培養(yǎng)瓶中。置溫箱中靜止培養(yǎng)5～20分鐘后，輕輕傾斜培養(yǎng)瓶，讓液體集中瓶角后慢慢吸出全部培養(yǎng)基液，再接種入B培養(yǎng)瓶中后；向A瓶中補(bǔ)充少許*培養(yǎng)液置溫箱中繼續(xù)培養(yǎng)；
（3）培養(yǎng)B瓶中細(xì)胞5～20分鐘后，接處理A的方法，把培養(yǎng)液注入C培養(yǎng)瓶中；再向B瓶中補(bǔ)加*培養(yǎng)基。
當(dāng)三個瓶內(nèi)都含有培養(yǎng)基液后，均在溫箱中繼續(xù)培養(yǎng)。如操作成功，次日觀察可見A瓶主要為成纖維細(xì)胞，B瓶兩類細(xì)胞相雜，C瓶可能主要為癌細(xì)胞。必要時可反復(fù)處理多次，直至癌細(xì)胞純化為止。
是用不銹鋼絲末端插有橡膠刮頭（用膠塞剪成三角形插以不銹鋼絲）、或裹少許脫脂棉制成，裝入試管中高壓滅菌后備用（也可用特制電熱燒灼器刮除）。刮除程序?yàn)椋?/p>
（1）標(biāo)記：鏡下觀察，用不脫色筆在培養(yǎng)瓶皿的背面圈下生長腫瘤細(xì)胞的部位；
（2）刮除：棄掉培養(yǎng)液，把無菌膠刮伸入瓶皿中，肉眼或顯微鏡窺視下，刮除無標(biāo)記空間；
（3）用Hanks液沖洗一兩次，洗除被刮掉的細(xì)胞；
（4）注入培養(yǎng)基液繼續(xù)培養(yǎng)，如發(fā)現(xiàn)仍有成纖維細(xì)胞殘留，可重復(fù)刮除至*除掉為止。
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