一：進入無菌室步驟
1、進入無菌室前應打開紫光燈進行滅菌，時間為0。5—1小時。
2、關燈后0•5小時后放可進入。
3、進入更衣間更換衣服，佩帶口罩、帽子、鞋套。
二：實驗步驟
1、進入無菌室后，先把酒精燈點燃，然后在用酒精棉進行手部消毒。（酒精棉是用75%的酒精加入脫脂棉中制成）。
2、準備雙料管3根，單料管6根，培養皿7個。
3、直接從原液中吸取10ml放入雙料管，（3根每根各10ml）。
4、再吸取原液1ml放入單料管中（3根每根各1ml）。
5、再吸取原液1ml放入培養皿中（2個培養皿各1ml）。
6、再吸取原液1ml放入鹽水管中制成－1梯度的樣液 。
7、更換一根吸管，從－1梯度的樣液吸取1ml樣液放入單料管中（3根每根各1ml）
8、再吸?。?梯度樣液1ml放入培養皿中（2個培養皿各1ml）
9、再把每個培養皿中到入營養瓊脂平鋪底部搖允（注另作3個培養皿：空氣空白，把培養皿打開十分鐘倒入營養瓊脂平鋪底部搖勻。瓊脂空白，把培養皿中倒入營養瓊脂平鋪底部搖勻。鹽水空白，吸1ml生理鹽水放入培養皿中，倒入營養瓊脂平鋪底部搖勻）。
10、把全部作好的放入培養箱中，溫度36C＋－1×C，大腸24H＋－2H，菌落48H＋－2H，（待培養皿中的瓊脂凝固后反轉過來放入培養箱中）
11、梯度：－1梯度為1ml原液加入9ml生理鹽水配成－2梯度為1ml－1梯度樣液加入9ml生理鹽水配成－3梯度－4梯度配制方法和－1、－2梯度的配制方法一樣。
12、如果大腸初發酵產生氣泡，用接種筆沾一個產氣的液在伊紅美蘭平板上畫之字形然后放入培養箱中36C，24H＋－2H 。（接種筆在每次使用前必須在酒精燈上消毒。所畫之形不能劃破伊紅美蘭瓊脂表面）。
13、取出后在用接種筆在伊紅美蘭平板之字形上挑菌，放入乳糖復發酵管中 ，然后再培養36C＋－1C，24H＋＋－2H。
14、再在伊紅美蘭平板之字形上挑菌，放到載玻片上作鏡檢。（方法見標準）。
15、只有鏡檢成紫紅色和乳糖復發酵管產氣同時成立的情況下，才能斷定這根管是不合格。
16、清洗消毒這根試管前必須進行消毒霉菌，121C，0。5小時同時不能放氣。
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